酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化模型方法与饲料

Model of alcoholic and nonalcoholic liver fibrosis and cirrhosis，and model diet）

长期大量饮酒导致毒性肝损伤，最初为肝细胞脂肪变性(脂肪肝)，进而发展为成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。不少研究者按照临床这种发展规律复制酒精性肝脏纤维化，结果是并没有复制出理想的动物模型，甚至失败，问题的原因在哪里，又怎样复制模型呢？

在前面介绍了酒精性脂肪肝模型的建立方法。一般来说，在实验动物中复制酒精性脂肪肝是比较容易的。问题是，在脂肪肝形成后，会不会向肝纤维化发展和发展的程度如何，这是我们复制肝纤维化模型所关心的问题。实际上，也是我们面临的困难。

我们先来了解肝纤维化的定义或规律。肝纤维化(live fibrosis)是肝脏内纤维结缔组织（胶原）的过度沉积，由纤维增生(Fibrogenesis，细胞外基质合成增加)和纤维分解(Fibolysis，细胞外基质降解)之间不平衡造成的结果。记住：是胶原的合成和分解不平衡，即合成大于分解，这对于模型复制是很重要的。

在复制的酒精性脂肪肝模型中，研究者在肝脏切片中除了看到脂肪变性或者脂肪肝的其他表现之外，一般都能看到有炎症反应（例如炎性细胞浸润），局造性坏死。但是，这些表现都比较轻微。只是在脂肪肝发展到非常严重的地步，肝脏的炎症反应和坏死比较明显。由于肝纤维化主要是在肝脏内慢性炎症、坏死的持续刺激下形成，因此，在所研究的绝大多数实验动物的肝脏中往往只是伴有轻、微的纤维变性，一般都不再发展。不仅如此，当撤销酒精而改成普通饲料喂养时，轻微的纤维变性可以转向消退（胶原纤维分解大于合成）。

在实验动物模型中的如此情形，只能证明人类酒精性脂肪肝向肝纤维化方向发展。那么，只能发生轻微的肝纤维化是不是证明人类酒精性脂肪肝不会发展到明显的肝纤维化，更不会发展到酒精性肝硬化阶段？

答案是否定的。研究已经证明，问题出在绝大多数实验动物与人类有比较大的差别。我们在复制酒精性肝纤维化模型时必需正视这种差别，事实上，正是这样的差别，复制酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化模型非常困难，方法很少。请继续往下阅读。

在上面说过，在绝大多数动物中并不能复制出理想的酒精性肝纤维化模型，原因出在实验动物本身。大鼠和小鼠等小型啮齿动物是很多研究者用于建立酒精性肝损伤的实验动物。现在我们就首先来看在大鼠和小鼠中酒精性脂肪肝和酒精性肝纤维化的模型情况。

在大鼠和小鼠等小型动物中长期给予酒精不能导致肝脏内纤维结缔组织的过度沉积。虽然能够造成脂肪肝，但是，不出现明显的肝纤维化。即便是采用Tsukaoto-French模型强迫性给予高浓度酒精液体饲料、造成血液酒精浓度持续维持在非常高的水平，所观察到的肝脏纤维化表现的程度也是有限的（毗邻小胆管周围轻度的纤维变性），更不能形成肝硬化。

再来看非人猿猴类动物。如果用酒精液体饲料（比如Lieber-DeCarli酒精液体饲料）长期喂养狒狒、恒河猴，不仅可以看到明显的肝脏纤维化表现，而且可以发展成肝硬化阶段。

从以上的比较，我们已经看出了不同实验动物之间的差别。

不仅仅应当看到这样的差别，还要注意的，虽然在非人猿猴类动物中能够复制出类似人类酒精性肝损伤演变成酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化的演变规律，但是，这需要几年的时间。

从上面的比较可以看出，人类酒精性肝纤维化发生中，酒精本身一个启动因子，而在发展过程中只是一个辅助因子。如此，不仅解释了为什么发展成酒精性肝纤维化的病人只是占了少量比例，而且也能解释在大多数实验动物难以复制肝纤维化和肝硬化模型：除了动物本身因素，而且单纯酒精的作用是有限或者温和的。

虽然复制酒精性纤维化和酒精性肝硬化困难，但是，还是有大量的研究论文对酒精性肝纤维化开展了研究。那么，是怎样复制酒精性肝纤维化模型的，我们又该怎样看待和怎样选择模型方法呢？

1.早期酒精性肝纤维化模型

在当前已经发表的相关论文中，使用非人猿猴类（灵长类）复制模型的实验的很少，这是可想而知的。绝大多数论文还是采用的大鼠和小鼠，采用的酒精液体饲料和模型方法与酒精性脂肪肝相同，有的是用Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养，有的是采用Tsukaoto-French模型给予胃内埋管方法。但采取了提高饲料中酒精含量和延长喂养时间的方法。在其他动物中也是采用单纯给予酒精的方法。

正如前面说过，这些方法建立的所谓肝纤维化模型，实际上是早期或者轻微的肝纤维化。在这样的模型，可以用于筛选酒精性肝纤维化的促进因子和抑制因子，或者探讨哪些因素促进肝纤维化，哪些因素抑制肝纤维化。

但是，我们要注意的是，这种模型毕竟是以脂肪肝为主，肝纤维化的程度轻微，因此，一般是基于肝脏病理切片中进行观察（例如，观察不同肝区胶原情况进行观察），或者对肝脏组织中胶原合成与分解相关的marker进行生化定量分析，或者对胶原相关的基因进行分析。但是，对于肝脏组织中的其他指标（比如肝功能指标）和血液中的指标难以与肝纤维化联系起来分析。

2.酒精性肝纤维化和肝硬化的研究模型

早期肝纤维化模型存在很多局限性，有时是“与其说在研究肝纤维化，不如说是在研究脂肪肝”，那么，怎样在实验动物中形成肝纤维化？怎样让肝脏纤维化发展到肝硬化？

毫无疑问，最理想的是采用非人猿猴类动物，用喂养Lieber-DeCarli酒精液体饲料即可。然而，往往做不到。

有些研究者采用了四氯化碳和酒精联合作用法在大鼠中成功复制出肝纤维化和肝硬化的模型。这种方法是基于小剂量四氯化碳不至于造成肝脏明显异常，但能加强酒精的致肝纤维化作用。其中，给予酒精的方法，有的是采用AIN93标准酒精液体饲料喂养，有的是给予Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养。

这种方法建立的模型表现出严重的肝纤维化和肝硬化，与人类酒精性肝硬化非常相似。关于这种方法，在大鼠酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化模型的模型方法网页中已经详细介绍。