应用铜缺乏模型饲料复制肺气肿模型的方法
Copper-deficient Diet: Pulmonary Emphysema Model

肺气肿模型有多种方法，在非吸烟肺气肿模型中使用的方法包括蛋白酶注射，例如木瓜蛋白酶（Papain）或弹力蛋白酶（elastase），或者给予山黧豆素（Lathyrogen）、镉（cadmium）、青霉胺（penicillamine）、神经酰胺（ceramide），等等。所有这些方法除了引起肺气肿，还引起肺广泛性损伤，使得肺气肿模型与人类肺气肿相差较大或者掺杂了很多其他改变。

这里介绍的是喂铜缺乏模型饲料进行造模。该方法所造出的肺气肿模型有如下优点：肺的病理改变非常类似人类肺气肿，不伴有肺部的炎症、感染和其他损伤，模型的时间过程类似人类肺气肿的过程。

铜是体内多种酶的辅助因子，尤其是SOD。铜也是肺泡发育的关键因子。因此，长期铜缺乏，肺弹力纤维（elastin）形成减少，从而发生肺气肿。在人类非吸烟的肺气肿病人，铜缺乏有显著相关性。

应用实验动物进行铜缺乏饲料喂养时，要注意理解不同实验动物在肺泡产生和发育方面的时间差异，例如：

大鼠和小鼠的肺泡产生是在胚胎期第4天和第14天之间，出生后继续发育。

豚鼠在出生时肺泡已经发育比较好，在出生后肺泡数量增加很小。

因此，铜缺乏模型必需从胚胎期开始。

以往的研究已经在大鼠、金黄地鼠、鸟、鸡、猪等实验动物中进行了造模研究，在豚鼠中也已经进行铜缺乏引起肺损伤的研究，从研究情况看，在上述动物中都能形成肺气肿模型。

不同动物使用的策略是有差别的。

例如，在大鼠和金黄地鼠是从胚胎期开始，喂缺铜饲料，直到出生后6周（至少），也就是，从妊娠期开始喂铜缺乏饲料，直到哺乳期全程。幼仔也吃相同饲料，直到模型期结束。

为帮助读者理解造模方法，我们提供了“大鼠肺气肿造模方法”（点击阅读）。

如果用猪复制模型，使用出生后第3-5天的猪，并开始喂缺铜饲料，直到出生后第30天时口服补充锌（每天每kg体重30-40mg锌，采用硫酸锌），目的是抑制赖氨酰基氧化酶（如果动物虚弱或状态差，则停止补充），同时肌肉注射右旋糖酐铁（iron extran），初始剂量是50mg铁，注射2次，然后每周注射1次，达到总量1g，在出生后第120天处死动物。

不论采用那一种实验动物，铜缺乏饲料和匹配的对照饲料都可以向南通特洛菲饲料公司购买到。

模型饲料质量是关键。铜缺乏是关键，然而，其他营养素必需控制在标准水平。至少有2方面的原因：

一是，必需保障动物只缺铜，否则，其他营养素或者饲料中其他成分也发挥影响，这就很可能发生的是铜缺乏合并其他成分的复合作用，影响造模。

二是，肺气肿造模容易，而造模的目的无非是分析生理、生化或分子生物学指标，或者进行药物干预，如果铜以外的饲料因素影响，则产生干扰，影响实验结果，使研究结论的可靠性下降，或者使得他人无法重复研究结果。 

（1）评估动物体重增加速度（体重不增加或比对照组小）

（2）称肺湿重，干重，计算肺含水量、肺干重/体重，湿重/体重。

（3）分析血清铜浓度、肝脏铜含量或/和肝脏细胞色素C氧化酶活性测定。

（4）肺弹性蛋白（弹力纤维，Elastin）测定（见下文）

（5）肺弹性蛋白组织学观察。光镜（HE染色）、电镜观察。醛品红染色法检测肺组织弹力纤维的分布，结构和量的改变。

（6）组织学肺气肿观察。（肺泡和肺泡管扩大）

（7）静态压力-容积曲线（V-P曲线）。注意：在大鼠中不容易做，一是模型大鼠的肺比较脆，二是模型大鼠肺容易出现胸膜漏（Pleural leaks）。还要注意的是，V-P曲线是功能性指标，而功能性改变不如形态学敏感，就是说，功能性指标没有改变不等于形态学没有改变，反过来说，形态学表现了明显变化，不等于说V-P一定有变化。

在上述评估项目中，肺弹性蛋白定量的测定方法如下：

（1）取出全肺，去除气管，浸泡除血，用滤纸吸干，称重。肺组织干燥至恒重（干重）。

（2）将脱水的肺放入5ml NaOH溶液（0.1N）浸泡至少3h。再在沸水中煮沸1h。冷却后离心，去除上清液，再放入0.1N的NaOH溶液中加热煮沸15min。离心去上清，加水、离心、去上清，如此“洗”两次，再用丙酮如此洗2次。放入烘箱（60度）干燥至恒重（干重），连同容器一起称重，去皮重后就是弹性蛋白的干重。 将弹性蛋白干重除以样品肺的干重，即得到相对%，进行两组间大鼠比较。