饲料类型:日粮型饲料。
辅助降血糖功能评价专用模型饲料:高热能饲料,按照中国FDA规定,产品代码:TP0850。
辅助降血糖功能评价对照饲料:标准饲料作为基础饲料,产品代码:LAD2001。
饲料外形:颗粒状(棒状)。
注1:本产品为辅助降血糖功能评价方法中的专用模型饲料,属于动物实验检验范畴,不建议作为科研用高血糖模型饲料。
注2:本产品已经按照规定的要求进行了配比,无需按照规定中所陈述的混合方法制作,既减轻了用户的负担,又避免了用户在混合过程中可能导致的营养素损失。如果用户希望自行混合,则请提前说明。
以上产品已经在多家鉴定单位使用,效果满意。
2012年4月23日国家食品药品监督管理局颁发了最新“保健功能评价方法”。这里是根据“辅助降血糖功能评价方法”中的动物实验部分的内容进行了整理。
分为方案一(胰岛损伤高血糖模型)和方案二(胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型)两种。
方案一(胰岛损伤高血糖模型):体重、空腹血糖、糖耐量。
方案二(胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型):体重、空腹血糖、糖耐量、胰岛素、总胆固醇、甘油三酯
1. 动物实验和人体试食试验所列指标均为必测项目。
2. 根据受试样品作用原理不同,方案一和方案二动物模型任选其一进行动物实验。
3 除对高血糖模型动物进行所列指标的检测外,应进行受试样品对正常动物空腹血糖影响的观察。
方案一:空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性,且对正常动物空腹血糖无影响,即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。
方案二:空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性,血脂(总胆固醇、甘油三酯)无明显升高,且对正常动物空腹血糖无影响,即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
1.实验动物:选用成年动物,选用小鼠(26+-2g)或大鼠(180+-20g),单一性别,大鼠每组8-12只、小鼠每组10-15只。
2.材料
(1)试剂
四氧嘧啶(C4H2N2O4•H2O,分子量160.08)或链脲佐菌素、地塞米松磷酸钠注射液、葡萄糖或医用淀粉、血糖测定试纸或试剂盒,胰岛素、甘油三酯、总胆固醇测定试剂盒。
(2)高热能饲料
猪油10% 、蔗糖15% 、蛋黄粉15% 、酪蛋白5% 、胆固醇1.2% 、胆酸钠0.2% 、碳酸氢钙0.6%、石粉0.4%、鼠维持料52.6%。
(3)仪器
血糖仪、全自动生化仪、可见光分光光度计、酶标仪、天平。
实验设三个剂量组和一个模型对照组,以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)为其中的一个剂量组,另设二个剂量组,高剂量一般不超过30倍,必要时设空白对照组。同时设给予受试样品高剂量的正常动物组。受试样品给予时间30天,必要时可延长至45天。
1. 正常动物降糖实验:
选健康成年动物按禁食3-5小时的血糖水平分组,随机选1个对照组和1个剂量组。对照组给予溶剂,剂量组给予高剂量浓度受试样品,连续30天,测空腹血糖值(禁食同实验前),比较两组动物血糖值。
指标判定:
血糖指标:空腹血糖受试样品剂量组与对照组比较无统计学意义,判定对正常动物血糖无影响。
2. 高血糖模型降糖实验:
方案一:胰岛损伤高血糖模型
【原理】
四氧嘧啶(或链脲佐菌素)是一种细胞毒剂,可选择性地损伤多种动物的胰岛 细胞,造成胰岛素分泌低下,引起实验性糖尿病。
【造模方法】
购入成年动物,适应1天后,随机取15只动物禁食3-5小时,测空腹血糖,作为该批次动物基础血糖值。随后动物禁食24小时(自由饮水),注射四氧嘧啶(用前新鲜配制)造模,小鼠45-50mg/kg BW.iv或125-130mg/kg BW.ip,大鼠50-80mg/kg BW.iv或120-160mg/kg BW.ip。5-7天后动物禁食3-5小时,测血糖,血糖值10-25mmol/L为高血糖模型成功动物。
【高血糖模型动物降糖实验】
选高血糖模型动物按禁食3-5小时的血糖水平分组,随机选1个模型对照组和3个剂量组(组间差不大于1.1mmol/L)。剂量组给予不同浓度受试样品,模型对照组给予溶剂,连续30天,测空腹血糖值(禁食同实验前),比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。
血糖下降率%= (实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值×100%
【高血糖模型动物糖耐量实验】
剂量分组及受试样品给予时间同1.4.2。各组动物禁食3-5小时,测定给葡萄糖或医用淀粉前(即0小时)血糖值,剂量组给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,15-20分钟后各组经口给予葡萄糖2.0g/kg BW或医用淀粉3-5g/kg BW,测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值或给医用淀粉后1、2小时的血糖值,观察模型对照组与受试样品组给葡萄糖或医用淀粉后各时间点(0、0.5、2小时)血糖值及血糖曲线下面积的变化。
血糖曲线下面积=【(0小时血糖+0.5小时血糖)×0.5 + (2小时血糖+0.5小时血糖)×1.5】/2
【指标判定】
空腹血糖指标:模型成立的前提下,受试样品剂量组与模型对照组比较,空腹血糖下降或血糖下降百分率升高有统计学意义,判定该受试样品空腹血糖指标结果阳性。
糖耐量指标:模型成立的前提下,受试样品剂量组与模型对照组比较,在给葡萄糖或医用淀粉后0.5、2小时任一时间点血糖下降(或血糖下降百分率升高)有统计学意义,或0、0.5、2小时血糖曲线下面积降低有统计学意义,判定该受试样品糖耐量指标结果阳性。
血脂指标:模型成立的前提下,受试样品剂量组与模型对照组比较,血清胆固醇或甘油三酯下降有统计学意义,可判定该受试样品降血脂指标阳性。
【结果判定】
空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性,且对正常动物空腹血糖无影响,即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。
方案二:胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型(任选其一)
地塞米松诱导胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型
【原理】:
糖皮质激素具有拮抗胰岛素生物效应的作用,可抑制靶组织对葡萄糖的摄取和利用,促进蛋白质和脂肪的分解及糖异生作用,导致糖、脂代谢紊乱,胰岛素抵抗,诱发实验性糖尿病。
【试验方法】
购入健康雄性大鼠(150 20g),普通维持料适应饲养3-5天,禁食3-4小时,取尾血,测定空腹即给葡萄糖前(0小时)血糖值,给2.5g/kgBW葡萄糖后测定0.5、2小时血糖值,作为该批次动物基础值。以0、0.5小时血糖水平分5个组,即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组,每组15只。空白对照组不做处理,3个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,连续35天。各组给予维持料饲养,1周后模型对照组和3个剂量组更换高热能饲料,喂饲2周后,模型对照组和3个剂量组在高热能饲料基础上分别给予地塞米松0.8mg/kgBW腹腔注射(0.008%地塞米松注射量1ml/100g体重),每日1次,连续10-12天。试验结束,各组动物禁食3-4小时,检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。
【观察指标】
空腹血糖、糖耐量
各组动物禁食3-4小时,测定空腹血糖即给葡萄糖前(0小时)血糖值,剂量组给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,空白对照组不做处理,15-20分钟后各组经口给予葡萄糖2.5g/kg BW,测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值,若模型对照组0.5小时血糖值≥10mmol/L,或模型对照组0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型糖代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后(0.5、2小时)血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积的变化。
血糖下降率%= (实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值×100%
血糖曲线下面积=【(0小时血糖+0.5小时血糖)×0.5 +(2小时血糖+0.5小时血糖)×1.5】/2
胆固醇、甘油三脂
各组动物禁食3-4小时,检测血清胆固醇、甘油三脂,若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型脂代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组血脂变化。
胰岛素
各组动物禁食3-4小时,检测血清胰岛素,模型对照组与空白对照组比较胰岛素抵抗指数无明显下降,且动物糖/脂代谢紊乱成立,判定胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型成功。观察模型对照组与受试样品组胰岛素抵抗情况。
胰岛素抵抗指数 = 胰岛素/22.5e-㏑血糖 ≈ 血糖×胰岛素/22.5
四氧嘧啶诱导胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型
【原理】
高热能饲料喂饲基础上,辅以小剂量四氧嘧啶(C4H2N2O4•H2O,分子量160.08),造成糖/脂代谢紊乱,胰岛素抵抗,诱发实验性糖尿病。
【造模方法】
购入健康雄性大鼠(150 20g),普通维持料适应饲养3-5天,禁食3-4小时,取尾血,测定给葡萄糖前(即0小时)血糖值,给2.5g/kgBW葡萄糖后0.5、2小时血糖值,作为该批次动物基础值。以0、0.5小时血糖水平分5个组,即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组,每组15只。空白对照组不做处理,3个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,连续33天。各组给予维持料饲养,1周后模型对照组和3个剂量组更换高热能饲料,喂饲3周后,模型对照组和3个剂量禁食24小时(不禁水),给予四氧嘧啶103-105mg/kgBW腹腔注射,注射量1ml/100g体重。注射后继续给予高热能饲料喂饲3-5天。试验结束,各组动物禁食3-4小时,检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。
【观察指标】
空腹血糖、糖耐量
各组动物禁食3-4小时,测定空腹血糖即给葡萄糖前(0小时)血糖值,剂量组给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,空白对照组不做处理,15-20分钟后各组经口给予葡萄糖2.5g/kg BW,测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值,若模型对照组0.5小时血糖值≥10mmol/L,或模型对照组0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型糖代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后(0.5、2小时)血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积的变化。
血糖下降率%= (实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值×100%
血糖曲线下面积=【(0小时血糖+0.5小时血糖)×0.5 +(2小时血糖+0.5小时血糖)×1.5】/2
胆固醇、甘油三脂
各组动物禁食3-4小时,检测血清胆固醇、甘油三脂,若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型脂代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组血脂变化。
胰岛素
各组动物禁食3-4小时,检测血清胰岛素,模型对照组与空白对照组比较胰岛素抵抗指数无明显下降,且动物糖/脂代谢紊乱成立,判定胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型成功。观察模型对照组与受试样品组胰岛素抵抗情况。
胰岛素抵抗指数 = 胰岛素/22.5e-㏑血糖 ≈ 血糖×胰岛素/22.5
【指标判定】
空腹血糖指标:模型成立的前提下,受试样品剂量组与模型对照组比较,空腹血糖下降或血糖下降百分率升高有统计学意义,判定该受试样品空腹血糖指标结果阳性。
糖耐量指标:模型成立的前提下,受试样品剂量组与模型对照组比较,在给葡萄糖或医用淀粉后0.5、2小时任一时间点血糖下降(或血糖下降百分率升高)有统计学意义,或0、0.5、2小时血糖曲线下面积降低有统计学意义,判定该受试样品糖耐量指标结果阳性。
血脂指标:模型成立的前提下,受试样品剂量组与模型对照组比较,血清胆固醇或甘油三酯下降有统计学意义,可判定该受试样品降血脂指标阳性。
【结果判定】
空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性,且血脂(总胆固醇、甘油三酯)无明显升高,对正常动物空腹血糖无影响,即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。
为了使实验动物糖代谢功能状态尽量保持一致,也为了准确地按体重计算受试样品的用量,实验前动物应严格禁食(不禁水),实验前后禁食条件应一致,鼠类在禁食的同时应更换衬垫物。
如用血清样品进行测定,应于取血后30分钟内分离血清,分离后血清的含糖量在6小时内不变。用血清制备的无蛋白血滤液可保存48小时以上。
高浓度的还原性物质如Vit C亦能与色素原竞争游离氧,干扰反应,使结果偏低。血红蛋白能使过氧化氢过早分解,亦干扰反应,致使测得血糖值偏低。故对已溶血的全血或血清必须制备无蛋白滤液后,再进行测定。
血糖测定方法:用试纸或试剂盒,按说明书操作;若自行配制试剂,按下列方法操作:略。
说 明